W celu uzyskania dalszego wglądu w efekt substytucji p.V155M na aktywność białka, zbadaliśmy doświadczalną strukturę 3D C-końcowej domeny cytosolowej (CTD) STINGa (14-16). Reszta V155 jest umiejscowiona w pierwszej wysoce hydrofobowej helisie (a5) CTD z STING, która tworzy intermolekularne interakcje hydrofobowe obejmujące również helisę. 7 (Suplementowa Figura 1). Wewnątrz dimeru, p.V155 znajduje się w centrum sieci hydrofobowej, w pobliżu najbliższego kontaktu między 2 podjednostkami (p.G158) (dodatkowa figura 1B). Ta sieć jest podobna niezależnie od stanu konformacyjnego białka (związanego lub nie z cyklicznymi dinukleotydami). Istnieje tylko jedna duża możliwość umieszczenia metioninowego łańcucha bocznego substytucji p.V155M (Suplementowa Figura 1C), która, według przewidywań, doprowadzi do utworzenia uderzająco ściślejszej sieci interakcji. Substytucja p1515M prawdopodobnie stabilizuje pozycję p.M271 z tej samej podjednostki, która tworzy silne oddziaływanie siarka-aromat z p.W161 z drugiej podjednostki. Powinno to wzmocnić stabilność dimeru. Jest zatem możliwe, że mutant p.V155M naśladuje efekt wiązania ligandu. Konstytucyjna aktywacja mutanta V155M in vitro. W celu zbadania aktywności zmutowanego białka STING p155M, zastosowaliśmy test reportera lucyferazy, który obejmuje IFN-y. promotor genowy. W tym teście nadekspresja białka STING typu dzikiego aktywowała promotor IFNB 2-krotnie ponad kontrolą w nieobecności liganda (Figura 2A). Stymulacja syntetyczną aktywacją promotora 2 ^ 3c-gGAMP wzmocniła w sposób zależny od dawki, a indukcji tej nie obserwowano przy braku STINGa (Figura 2A). Przeciwnie, zmutowana aktywność reportera p.V155M pod nieobecność syntetycznej stymulacji ligandem i stymulacja syntetycznym 2 3 (3-gGAMP nie dalej aktywowała aktywność reportera na znaczący poziom. Dane te dodatkowo sugerują, że mutacja mutacji p.V155M zapewnia konstytutywną aktywację niezależną od wiązania ligandu. Co ciekawe, zmutowana ekspresja STING była zmniejszona w porównaniu z ekspresją STING typu dzikiego (Figura 2B). Tak więc obserwowane zwiększenie aktywności nie było wynikiem nadekspresji białka i mogłoby sugerować, że mutant jest mniej stabilny niż białko typu dzikiego lub że zmutowane białko jest bardziej prawdopodobne, że zostanie zdegradowane. Figura 2 Konstytucyjna aktywacja zmutowanego STING in vitro. (A) indukcja lucyferazy w komórkach HEK293FT kotransfekowanych pustym wektorem (EV), STING typu dzikiego, V155M STING i plazmidem lucyferazy pod kontrolą promotora IFNB i stymulowane wzrastającymi ilościami syntetycznego 2. 3 (3-cGAMP skompleksowanego do lipofektamina (maksymalna dawka, 4 .g / ml, współczynnik rozcieńczenia dawka-odpowiedź, 3) (n = 3, średnia i SEM, test t dla par, * P <0,05) [patrz też: badania laboratoryjne cennik, sztyblety do jazdy konnej, mazurek kajmakowy przepis ] [podobne: plastry compeed, niedobór magnezu w ciąży, śmierć kliniczna przeżycia ]
