W dotkniętej chorobą skórze P1-1 i P2-1 utrata ekspresji genu-1 była związana z cienkim naskórkiem, mikroblisterami w DEJ, silną redukcją keratynocytów Ki-67-dodatnich i nieregularnym barwieniem kolagenu VII w DEJ oraz w górna skórka. Przeciwnie, w normalnie występujących pasmach P1-3 i P2-2 z przywróconą ekspresją kindlin-1 (strzałki), morfologia skóry, barwienie Ki-67 i dystrybucja kolagenu VII były porównywalne z tymi dla kontroli. Skalowane pręty: 50 .m. P2, 24-letnia kobieta homozygotyczna z c676dupC, wykazywała wiele normalnie pojawiających się plastrów, mierzących 0,5 2 2 cm2, wyraźnie odróżniających się od zaniku atroficznego (ryc. 1, D i E). Immunofluorescencja Kindlin-1 była ujemna w skórze dotkniętej chorobą, ale dodatnia (porównywalna ze skórą kontrolną) w 2 prawidłowych wyglądach (Rycina 2, D i E oraz Tabela uzupełniająca 1). Zarówno w P1, jak i P2 przywrócona ekspresja natywnej-1 wyraźnie poprawiła morfologię skóry (tj. Zachowanie grzbietów rete, grubości naskórka i proliferacji keratynocytów, Figura 2, C i E). W celu oceny integralności DEJ zastosowano barwienie kolagenem VII. W normalnie wyglądających obszarach z pozytywnym wybarwianiem typu. Llin-1, zaobserwowano liniowy sygnał VII kolagenu, który przeciwstawiał się nieregularnemu wzorowi w obszarach dotkniętych chorobą (Figura 2, B. E), co wskazywało, że przywrócenie typu. normalizowało DEJ. Wyniki te silnie potwierdziły hipotezę, że normalnie pojawiające się plamy pozytywne typu -linlin-1 reprezentują obszary, na których odwrócone mutacje powróciły. Aby to przetestować, użyliśmy laserowej mikroskopii rozciętej (LDM) do zbierania keratynocytów z obszarów o zmienionym lub prawidłowym DEJ. DNA wyekstrahowano, a eksony 4 i 5 FERMT1 zsekwencjonowano odpowiednio w P1 i P2. U obu pacjentów mutacje stwierdzono w stanie heterozygotycznym w keratynocytach pochodzących z wszystkich prawidłowych wstawek, podczas gdy w skórze chorej mutacje były obecne w stanie homozygotycznym, podobnym do limfocytów (fig. 3 i tabela uzupełniająca 1). W skórze właściwej poniżej obszarów przywróconych mutacje były obecne w stanie homozygotycznym. Tak więc odwrócenie nastąpiło tylko w keratynocytach, które są jedynymi komórkami wyrażającymi ekspresję genu-1 (3 w skórze (8, 9). Wyniki potwierdzono w P2 na poziomie RNA (dane nie pokazane), ale nie otrzymano żadnego materiału z P1. Warto zauważyć, że u obu pacjentów ten sam mechanizm rewersji (tj. Pojedyncza nukleotydowa delecja przywracająca liczbę zasad w bezpośrednich powtórzeniach) została znaleziona we wszystkich rewertacyjnych łatach, co sugeruje wysoką skłonność sekwencji do zdarzeń mutacyjnych poprzez ześlizgnięte błędy w interpretacji (12). ). Rysunek 3 Identyfikacja mechanizmu zwrotu. LDM zastosowano do zbierania naskórkowych keratynocytów z obszarów o zmienionej lub normalnej morfologii DEJ
[patrz też: poradnia ortopedyczna bydgoszcz, problemy wychowawcze w przedszkolu, leczenie nietrzymania moczu ]
[patrz też: czy kawa rozpuszczalna jest zdrowa, olej z wiesiołka na twarz, szpital bonifratrów w łodzi ]
