Ponadto przeanalizowaliśmy metylację histonu H3 w podzbiorze próbek ATA z mutacją EZH1 lub bez niej. Wszystkie analizowane ATA z mutacją EZH1 miały wyższe poziomy trimetylacji i tendencję do niższych poziomów dimetylowania w porównaniu z tymi wykrywanymi zarówno w odpowiednich próbkach NST, jak i ujemnych ATA mutacji EZH1 (Figura 3C). Wzrost trimetylacji histonu H3 jest podobny do stwierdzanego w przypadku mutacji EZH2 w chłoniakach grudkowych i rozlanych dużych limfocytów B (16). Mechanizm prawdopodobnie jest inny. Mutacje EZH2 w chłoniaku z komórek B wpływają na reszty (Y641 i Y677), które są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie substratu (14), zmieniając w ten sposób swoistość substratu na korzyść dimetylowanego histonu H3, prowadząc ostatecznie do zwiększenia trimetylacji Lys27 (17). Mutacja EZH1 znaleziona w naszym badaniu (Gln571Arg) wpływa na resztę eksponowaną na rozpuszczalnik w regionie, który jest silnie konserwowany między EZH1 i EZH2. Biorąc pod uwagę informacje dostępne dla EZH2, ta reszta prawdopodobnie nie bierze udziału w wiązaniu substratu, ale może odgrywać rolę w oddziaływaniu z podjednostką supresorową homologu zestez 12 (SUZ12) PRC2 i kofaktorem białka wiążącego adipocyty 2 adypocytów (AEBP2), który jest wymagany do optymalnej aktywności enzymatycznej (18, 19) (Figura 2, B i C). W związku z tym zbadano interakcję pomiędzy mutantem Gln571Arg i komponentami PRC2 (SUZ12, AEBP2 i rozwój zarodkowej ektodermii [EED]) przez koimmunoprecypitację (Suplementowa Figura 4). Nie wykryto różnic między WT a zmutowanymi białkami EZH1, co sugeruje, że mutacja Gln571Arg nie rażąco zmienia te interakcje. Konieczne będą szczegółowe badania strukturalne w celu dalszej analizy mechanizmów leżących u podstaw zwiększonej aktywności spowodowanej mutacją Gln571Arg. Figura 3Funkcjonalna charakterystyka mutanta EZH1 Gln571Arg. (A) Wpływ EZH1 Gln571Arg na metylację histonu H3 w Lys27. Wzorzec metylacji w lizatach z komórek transfekowanych znakowanym FLAG EZH1 WT / Gln571Arg lub pustym wektorem ekspresyjnym (kontrola) oceniano za pomocą analizy Western blot z Abs wobec mono- (H3K27me1), di- (H3K27me2) i trimetylowania (H3K27me3) . Ekspresję transfekowanego EZH1 oceniano stosując Ab przeciwko znacznikowi FLAG. (B) metylowanie H3K27 w liniach komórkowych tarczycy stabilnie (FRT) lub przejściowo (PCCL3) transfekowane EZH1 WT / Gln571Arg. (C) Metylacja H3K27 w próbkach ATA z mutacją EZH1 Gln571Arg lub bez niej i odpowiadającymi NST. (D) Proliferacja komórek FRT trwale eksprymujących EZH1 WT / Gln571Arg. Żywotność komórek mierzono za pomocą testu MTT. Dane (n = 8) są przedstawione jako średnia. SEM. *** P <0,001 względem kontroli; §§P <0,01 versus EZH1 WT; §§§P <0,001 versus EZH1 WT [przypisy: ludzie którzy przeżyli śmierć kliniczną, olej kokosowy rafinowany czy nierafinowany, problemy wychowawcze w przedszkolu ] [patrz też: problemy wychowawcze w przedszkolu, niedobór magnezu w ciąży, jak dobrze dobrać stanik ]
